Western Blot免疫印跡法主要步驟

主要包括以下 4 個基本步驟：樣品制備；電泳分離；蛋白的膜轉移；免疫雜交與顯色――蛋白檢測。

溶液和試劑


1. 1X 磷酸鹽緩沖液(PBS)


2. ModifiedRIPAbuffer：Tris-HCl:50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA:1 mM ;PMSF: 1 mM;Aprotinin,leupeptin,pepstatin:1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM;NaF: 1 mM


3. 1X SDS 樣品緩沖液：62.5 mMTris-HCl(pH 6.8 于 25° C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mMDTT, 0.01% w/v溴酚藍


4. 轉移緩沖液：25 mM Trisbase, 0.2 M *, 20%甲醇 (pH 8.3)


5. 10X Tris緩沖鹽 (TBS)：準備1L 10X TBS：24.2 g Trisbase, 80 g NaCl；用1N HCl調pH為 7.6


6.甲醇


7. TBS/T緩沖液：1X TBS, 0.1% Tween-20


8. 封閉緩沖液（TBS/T）：1X TBS,0.1% Tween-20加5% w/v 脫脂奶粉或BSA


9. 一抗的稀釋：1X TBS,0.1% Tween-20 加 5% BSA ( 多抗) 或 5%脫脂奶粉( 單抗)。Note： 一般來說，BSA被*用于多克隆抗體，脫脂奶粉用于單克隆抗體，這樣可得到較高的信噪比。預染的蛋白質Marker，可用于監測轉膜的效率。

樣品制備


原始樣品可為細胞、組織、培養上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為 定性檢測目的蛋白時細胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關文獻。


1．培養細胞或藥物處理。


2．棄培養基，用1X PBS漂洗細胞2次，去盡殘留培養基。


3．加入1X SDS樣品緩沖液(6-well plate,100μl /w或 75 cm2 plate,500- 1000μl/瓶) ，刮落細胞，轉移到Ep管。注意：冰上操作。


4．超聲 10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。


5．煮沸樣品5 minutes。


6．離心12000g，5 min，取上清。


7．電泳分離：上樣15μl~20μl 至 SDS-PAGE 膠 (10 cm x 10 cm)電泳。 如要定量檢測某蛋白的表達水平， 應用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/100 mm dish/150cm2 flask)裂解細胞， 收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混勻4～15min，14000g離心15min（4℃），棄沉淀，用Bradford法或其它蛋白質測定方法測定上清中蛋白濃度以調整上樣體積和上樣量，進行Western雜交時還需設置內或外參照，通常用beta-actin。


注意：一般上樣20~30 μg已足夠，如待檢蛋白為低豐度蛋白，可加大上樣量 至100μg，但電泳條帶易拖尾，可制備亞細胞組份或采用更敏感的檢測方法。

電泳分離（參照SDS-PAGE電泳方法） 轉膜


雜交膜的選擇是決定 Western blot成敗的重要環節。應根據雜交方案、被轉 移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質、孔徑和規格的雜交膜。用于Western blot的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜(NC) 和 PVDF 膜。NC 膜是蛋白印跡實驗的標準固相支持物，在低離子轉移緩沖液的環境下，大多數帶負電荷的蛋白質會與膜發生疏水作用而高親和力的結合在一起， 但在非離子型的去污劑作用 下，結合的蛋白還可以被洗脫下來。根據被轉移的蛋白分子量大小，選擇不同孔 徑的 NC 膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結合就越牢固。 通常用 0.45μm 和 0.2μm 兩種規格的 NC 膜。 大于20kD 的蛋白可用 0.45μm 的膜， 小于 20kD的蛋白就要用 0.2μ m 的膜了， 如用0.45μm 的膜就會發生“Blowthrough”的現象。PVDF 膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規的膜要高，非常適合于低 分子量蛋白的檢測。但 PVDF 膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和 1-5 秒鐘。


蛋白質常用的轉移方法主要有兩種：槽式濕轉和半干轉移。前者操作容易， 轉移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉移，所用緩沖液少。以下為槽式濕轉的 操作步驟。


1. 將膠浸于轉移緩沖液中平衡 10min。 注意：如檢測小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴散出膠。


2. 依據膠的大小剪取膜和濾紙6 片， 放入轉移緩沖液中平衡10min。 如用P VDF 膜需用純甲醇浸泡飽和 3-5 秒鐘。


3. 裝配轉移三明治： 海綿 3 層濾紙 膠 膜 3 層濾紙 海綿， 每層放好后， 用試管趕去氣泡。切記：膠放于負極面（黑色面）。


4. 將轉移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面對黑色面），加轉移緩沖液， 插上電極，100V，1h（電流約為 0.3A）。注意：應再次檢查三明治和電極是否裝配正確，電源是否接通。


5. 轉膜結束后，切斷電源，取出雜交膜

免疫雜交與顯色

1．用25 ml TBS 洗膜5min，室溫，搖動。

2．置膜于25 ml 封閉緩沖液中1h, 室溫，搖動。

3．15mlTBS/T洗3次（5 min/T）。

4．加入合適稀釋度的一抗，室溫孵育1-2h或4°C過夜，緩慢搖動。

5．15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。

6．加入合適稀釋度的堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化酶（HRP）標記的二 抗，室溫孵育1h，緩慢搖動。

7．15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。

8．15 ml TBS洗1次。

9．蛋白檢測( 顯色法或發光法，按相應試劑說明操作) 。

注意事項：

1．操作中戴手套，不要用手觸膜。

2．PVDF膜在甲醇中浸泡時間不要超過5秒。

3．如檢測小于20kD的蛋白應用0.2μm的膜，并可省略轉移時的平衡步驟。

4．某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫，此時可用1.0% BSA代替Tween-20。

5．關于封閉劑的選擇：5%脫脂奶/TBSor PBS: 能和某些抗原相互作用，掩蓋抗體結合能力；0.3~3% BSA in PBS：低的內源xing交叉反應性。

6．如用0. 1% Tween20、0.02% NaN3 in PBSor TBS作封閉劑和抗體稀釋液，抗體檢測后可進行蛋白染色。

7．如要同時檢測大分子量和小分子蛋白，用梯度膠分離蛋白。